604
Білок Diggers або де протеїн видобувається
Головна
35 фото + листи
Всі ми були в школі, і у нас були біологія і хімія підручники. Деякі люди, ймовірно, читають їх до. Часом ми почуємо в новинах, які британські вчені здійснили черговий прорив і іноді навіть заслали Нобелівську премію за їх відкриття. І хто, мабуть, уявляв розумний сіро-волосий чоловік з келихами, хто все своє життя думав багато, був блискучим і колись він підсвічував ідею. Ну, я скажу вам це, в дійсності, є рідко одна людина за всіх цих відкриттів. Як правило, є завідувач лабораторії (і пізніше він дасть йому Нобелівську освіту в разі якого є ціла команда вчених, аспірантів, аспірантів і просто студентів). Важко уявити, скільки робіт насправді вводять в єдиний ряд біологія або хімія підручник. Визначені методи краще і більш точно вимірюють результат. Один експеримент може тривати з декількох годин до декількох років (в залежності від предмета дослідження). Один рядок у підручнику іноді займав роки
Так я студент біохіміолога, я 29 років, і я люблю, що називається Лу. Я жити життя експериментального вченого, і це життя нагадує мені дуже багато життя саркерів з деяких фантазійних книг. У наших вежах магії десятирівневих лабораторій, які з яких причин у багатьох містах світу проводяться поза межами міста, щоб не перетворити очі звичайних громадян, очевидно. Вже в Німеччині я мав офіційну адресу: "Вулиця так і-со, Вежа 4." Я зараз працює в Страсбург, Франція. Ми працюємо з усіма сортами пристроїв, метою яких не можна вгадати їх зовнішній вигляд, а також читати дивні листи, які за межами влади смертної, ініціатор повинен навчатися протягом багатьох років, щоб зрозуміти в них деякі девілі.
Хочу показати звичайний будиночок звичайного аспіранта (четвер 21.07.11 – хоча будні, вихідні, що різниця...) і докладно розповісти про те, що і чому ми працюємо, бо я люблю. З Про те, що люди роблять інші професії, я думав, що хтось може зацікавити вивчення біохіміки. Крім того, раптом якийсь сумнівний студент побачить цю посаду і вирішить, чи варто його відправити ноги в аспірантуру (це справа, дуже любитель). Я також справді цікавий, чи можу я пояснити фальману дуже базові техніки, що використовуються в біохімії. Так, в посту буде багато труб, дивних пристроїв, пристроїв, банок, капілярів. І багато пояснень і технічних деталей.
Я маю на увазі більшість людства, що є совами. Всі роки мого життя, проведеного в школі, університеті, праці, аспірантів та не зробили мене звикнути до відкликання життєрадісних ранок і швидко розвивається окропом. З якоїсь причини, є багато сов серед вчених, і вони, безумовно, швидко придумують наукову доказ, що ви сова або свинка, за рахунок особливостей вашого метаболізму. В цілому, цитуючи це докази, я мирно прокинувся три тривожні годинники (в 8:15, 8:45 і 9:00) до того, як біологічна тривога відходить. Мій біологічний набір до десь між 9:40 і 9:50. 10 хвилин після стирання очей, я все-таки кинувся в ліжку і відірвав вікно. Зовні вікна, якщо ви щасливі, вони дають вам хмари.
В кінці я все ж отримую, бо вчені не придумали телепорту. Тому що я люблю спати, я еволюціонував звичку готовності дуже швидко вранці. Я промив, отримаю, захоплюю сумку (його потрібно всього 10 хвилин для всього), не їсти сніданк і «за роботою, для роботи, до моєї улюбленої роботи !!!» Прогулянка по роботі також 10 хвилин. У кущах ми знаходяться.
...
Привіт, робоче місце!
...
Я отримаю, але, як і раніше вранці в моїй голові, я в автономному режимі. Мені потрібно пити каву (який майже не впливає на мене) і їсти щось солодке, потім дайте. Звичайно, не можна їсти і пити в лабораторії самостійно, але це можливо в спеціально призначеному для цього місці.
Після кави я все ще прочитав інтернет трохи, я явлю мій розум, я покладаю нітрилові рукавички на руках і бігу до розвитку насильницької діяльності. Ми працюємо, звичайно, всі час надягаючи рукавички, по-перше, так що все, що не стежить падає на руки, а по-друге, щоб не довести бруду в надчисті зразки.
Митець працює з пензлем, піаніст грає фортепіано, і я провадив цю трубу щодня. Цей вид трубок збирають невеликі обсяги рідин - все, що менше одного мілілітеру і до 1 мікролітера. Один мікролітер є таким крихітним падінням. Для порівняння, якщо ви заглиблюєте добре відоме скло труби, скажте, краплі в очах - потім одна така крапелька буде близько 200 мікролітерів. Трубка має знімний одноразовий наконечник, який можна побачити на фото, щоб кожна нова рідина набирається чистим наконечником.
Тепер кілька слів про те, що ми будемо робити сьогодні. Я вибрав найбільш типовий день для оповідання. Більшість післядипломних біохіміологів по всьому світу займаються досить монотонною діяльністю, а саме, очищаючи білки (= "протеїни") і поставляючи різні тести з ними. Білки – загальна назва для величезного класу біологічних молекул. Чому випускники по всьому світу мають стільки білків? Справа в тому, що в живих білках клітин виконують різні функції. Уявіть, скажте, автомобільна фабрика. Якщо вся рослина є живою коміркою, то практично все всередині — всі машини, транспортери, працівники та самі автомобілі — будуть білки. Вчені, перш за все, вивчити саме те, які функції виконує певний білок в клітині. По-друге, білки з відомими функціями можна використовувати як інструменти для подальших досліджень. Якщо ми хочемо використовувати білок, де ми отримуємо? Звісно в живому клітку! Це де вони виробляються в великих числах! Бактеріальні клітини найчастіше використовуються для цього, тому що вони дуже легко і недорого, щоб підтримувати і швидко рости. Методи сучасної генетичної інженерії дозволяють нам програмувати клітини так, щоб є велика кількість білків, які нам потрібно. А потім отримуємо його звідти і очищаємо його. І ми використовуємо його в експериментах.
Бактеріальні клітини вирощуються в рідкому поживному середовищі. Наприклад, в таких флаксах (пляшка на 5 л, рідина в ній 1 л), які знаходяться в кімнаті, де температура постійно підтримується при 37 ° С (або в термостатичному шафі). Флакс фіксуються на спеціальній платформі, яка постійно обертається і сяє вміст, при цьому поживний середовище збагачений киснем, і бактеріями краще з цього виростають. Це фото з вчора, але це весело побачити, де бактерії живуть в лабораторії. Ніч перед тим, як виростили бактерії до потрібного етапу, потім проповідували бактеріальні клітини з рідини (посмоктуються в центрифуги і скручуємо 6000 оборотів в хвилину, бактеріальні клітини є «свіжим», а отже оселилися до дна судна від центрифугальної сили), викопавши їх знизу посудину шпателем і миттєво заморожують в рідкому азоті (температурно-196 ° С). Миттєве заморожування є важливим для того, щоб клітини та їх вміст не починають зламатися від такого лікування бразен (і ми пам'ятаємо, що ми хочемо, щоб екстракт дорогоцінного білка, який біореакторні клітини зробили нас).
р.
Так, о 11:08, і я зносу рукавички, що працюють на морозильну камеру, заморожують день до. Заморожені клітини та інші цінні зразки зберігаються в морозильній камері -80°C. Я відкрию морозильну камеру, і перше, що я з неї заливають товсту пару.
Швидко, щоб не заморожувати пальці в рукавичках, я кистью кашети, приготовані з вечора. Вони загорнуті в тантіль, і я ламав їх, як цукерковий бар на менші шматки, поки вони плавають. Коли вони щелепи, люмп клітин буде виглядати як шматок сіро-коричневого пластиліну з дуже яскравим запахом. Бактерія, яка зазвичай використовується в лабораторії, називається Escherichia coli, або E. coli для коротких. Це один і той самий кишковий коліт, який кілька кілограмів живуть в кишечнику кожного з нас. Не дивлячись на тіло, він, хоча він має дуже характерний запах, все ще запахи не відходи. Однак я боїться людей, які не звикли до неї, поціновувачі з тонким почуттям запаху, не б назвати цей запах приємним.
На шляху до морозильної камери ми зберемо лід в ящику - будемо тримати зразки на льоді, так як при низьких температурах всі з'єднання набагато стійкіше.
13469.
Ми кладемо плавлені клітини бактерій в тестовій трубі і заливаємо спеціальний розчин солі. Розчин необхідний для того, щоб білок ми намагалися витягти з клітин, що залишаються непристойними під час всіх процедур очищення. На фото ще одна трубка, більша, для томів до 30 мл.
Так ми маємо клітинки, які плавають в розчині. Всередині клітин є компонент (протеїн) ми бажаємо. Щоб отримати її, потрібно спочатку знищити клітинну мембрану так, щоб вміст розтопився. Існують різні способи знищити клітинку, залишаючи його вміст непристойним. Сьогодні ми використовуємо ультразвук для цього. І це те, що виглядає клітина-деструктор - це насправді металевий штифт, який ми будемо покласти прямо в тестовій трубі. Пиріг коливається на дуже високій частоті, створюючи ультразвукові хвилі в середовищі - з яких знищуються клітини. Пристосування дуже розтирання і шліфування, щоб вона була зафіксована в шафці з звукоізоляцією. І тестова трубка з клітинами необхідно тримати в льоді, тому що ультразвукові хвилі мають високу енергію, і зразок дуже гаряча.
Процедура руйнування займає близько 20 хвилин. Це фото показує, що перед руйнуванням клітин, зразок був більш світлим, після руйнування, його потемніли і стали більш в'язкими (візостійкість не видно, звичайно, але я кажу вам). В'язкість набута через те, що всі біополімери (довге молекули, як ДНК і білки), які були всередині клітин, зараз протікали.
Тепер у нас є свого роду «суп» сформований в тестовій трубі, в якій нічого не купує! Всі компоненти, які були в клітинах, і є тисячі з них, випливають і перемішують. Уявіть, що у вас є хороший пивоварний борщ, і вам якось потрібно отримати тільки крихітні шматочки петрушки з нього, і нічого іншого в будь-якому випадку отримується! Як? Ну, я не знаю про борщ, але як риба з правої молекули, біохіміки давно придумали. Ми будемо робити кілька кроків очищення. Перш за все, ми покладемо нашу «супу» в центрифугію і спину на порівняно низькій швидкості (10 000 об/хв). При цьому курсі великі частинки, такі як фрагменти бактеріальних стінок клітини, поселяться на дно, і всі менші частинки, включаючи наш білок, залишаться плаваючі в розчині. Це те, що трубка з осадом виглядає так - ми відкидаємо її, але будемо приймати рідину для подальшого очищення. Повідомляти, як темний він так далеко. 15 хвилин.
р.
У наступному кроці ми позбавимо від нуклеїнових кислот (всі відомі ДНК і РНК), які також поплавляємо в зразок у великій кількості. Ми додамо спеціальний реагент, який викликає їх до преципітації. Фото показує зразок перед (лівою) і після (праворуч) додавання реагенту.
Ми збираємося поставити це в центрифугію, і ми будемо обертати його 10000 об/хв, і ми знову кидаємо його, і ми збираємося його назад. Повідомляйте, як яскрава. 20 хвилин.
Тепер існує ще один аналогічний крок очищення, монотонний, але ефективний. Останній етап обробки, потім більше задоволення Заливаємо строго визначену кількість білого порошку (соло сульфату амонію) в розчин. Невелика хитрість – це предпілювати багато різних білків, які нам не потрібно, і наш дорогоцінний збережеться в розчині! Декілька інших випускників років тому була заплутана і підбирала точну кількість білого порошку, потрібно взяти, і зараз я з використанням досвіду поколінь, щоб говорити. Але це просто означає, що я промовляю щось інше.
А що про зразок — ми вже знаємо, за встановленою схемою, ми закрутимо її в центрифуги, беремо рідину, переносимо її на чисту чашку і залишаємо її в холодильнику, тому що у нас є перерва на обід! Так це 13:00 на годинник.
5 хвилин до їдальні. Французька їдальня заслуговує ліричний відступ! Це найкраща їдальня я коли-небудь бачив, хоча вони кажуть, що це не найкращий в Страсбургі. Француженка, звичайно ж, не мусить їсти. У якій іншій їдальні ви знайдете близько десятків салатів самостійно, не кажучи вже про основні страви. Страви, до мого смаку, з захопленням - креветки з грейпфрутом, рокефорт з арубу, куркою з ананасом і тріщинами і все інше. Крім того, салати не просто розбризують на пластини великого басейну, так як вони роблять, наприклад, в Німеччині, і на кожну тарілку салат художньо прокладений - естетично складаний шинка, кладуть скибочку лимона / яйце / оливкова і навіть соус іноді заливають загартовою паличкою. Тексти пісень, а це означає: І перш за все, це смачно! Взагалі салати захопили мене, тому я їсти їх за найбільшу частину, і я навіть не доходжу до основних страв, але все також є художньою і смачною. Після того, як вони подарували деякі запіканки, запечені в великій оболонці в сирому соусі. У Німеччині я бачив багато різних цуценят, всі з них подаються до скидання, деякі смачні, але ніколи не приносили стільки естетичних до їжі. Ми часто їдемо на обід з двома щасливими колегами.
Але це 13:50 і час, щоб повернутися до роботи. Ми наносимо на петлю пальця і підійдемо до Північного полюса за цим практично броньованим дверима. Не жарт, що ми продовжуємо працювати в номері, де температура 4°C. Він холодний, людина.
Зовні двері! Це так! За дверима, серед інших речей, цей блок.
р.
Я за пристрій.
Я зізнаю, що коли я побачила цей пристрій як студент, я майже побігся з страхом. Здавалося б, що це абсолютно неможливо зрозуміти що-небудь, і з точки зору складності було порівняти підводний човен. Навколо є кілька банок, конусів, пучок капілярів, які приклеюються з пристрою, кожен власному розчині, додаткові деталі прикріплюються до пристрою і непаровані, з яких є різні і різні. Ну, девіла гонна ламає ногу.
По суті, все стало набагато простіше. Це називається хроматографом. Застосовується при наявності суміші декількох компонентів і їх потрібно відокремити один від одного за допомогою. Хроматографи приходять в багато різних типів, зокрема, це рідкий хроматограф. Один з його компонентів є насосом, який здатний перекачувати рідину (тобто наш зразок) з точки A до точки B. По дорозі зразок пройде через спеціальну «очищаючу установу», яка дозволить нам позбутися від небажаних домішок. Розділені стовпчики в діапазоні:
Отже, перед обідом ми залишили напівочищену білкову суміш в холодильнику. Але є тільки один лівий! Поставте суміш в хроматограф і подивіться, що відбувається. Ми набираємо наш зразок в шприц і акуратно вставляємо його в внутрішню камеру хроматографа.
Потім натисніть кнопку старту і різко диміть в кутку, що дивиться на результат!
Як відокремити різні молекули один від одного? Існують різні способи. Кожен білок унікальний, має певні розміри, зарядні та поверхневі властивості. Ці якості будуть використовуватися для відокремлення суміші. Найчастіше застосовуються кілька кроків очищення, наприклад, спочатку за розміром, потім заряджаються.
Пам'ятка кіндерелла. Після того, як вона була надана сумкою різних злаків і розповіла про те, щоб взяти лише одну. Якщо Cinderella була технічна думка, вона підійшов з сито. І ще краще, кілька сидів в серії з клітинами різних розмірів. Так, спочатку можна взяти тільки найдрібніші, наприклад, пшениця, потім щось більший, наприклад, ленти, а потім ще більші, наприклад, горох, квасоля. Для окремих білків біохіміки придумали так званий «молекулярний сито» - матеріал, який має пори дуже, дуже невеликий розмір. Склад молекулярного сита полягає в тому, що це тривимірне. Повільний циліндр заповнюється мікроскопічними намистинами, і є отвори в бісерінці. Система працює таким чином: великі молекули не вписуються в отвори в бісерінці, тому вони швидко падають між намистинами, нічого не затримує їх. Невеликі молекули піднімуть в отвори в бісерінці і застрягають там, вони займають набагато довше, щоб досягти виходу. Рідкий вихід циліндра, спеціально підготовлений міні-робот відразу пропускає через труби. Оскільки великі і невеликі молекули залишають циліндр в різні часи, вони закінчуються в різних трубах. Ми просто повинні взяти потрібну тестову трубку, що містить продукт, який ми зацікавлені. І ми поділили молекули за розміром. Ні, я не знаю, чому поїзд говорить L'Oreal, я не працюю там.
Проведення сепарації молекул близько 4 годин. Після цього відділення іноді є багато труб на виході. Це так:
Якщо ви уважно дивитеся, то помітно, що 3 і 4 труби трохи відрізняються кольором, ніж всі інші. Попереду я можу сказати, що це буде продукт інтересу до нас. Розмальовуємо, нехай не йому, але деякі супутні сполуки, які ми позбавимо від майбутнього.
Але ми не знаємо нічого про це ще, ми тільки вгадуємо, де наш продукт може бути, тому що є вбудований детектор в хроматографі, який сяє через рідину, що протікає через неї з ультрафіолетовим світлом і «дивує» чи є щось в ньому або ні. Тим не менш, датчик може дати відповідь так/не, але не знаю, що присутній в кожній тестовій трубі. Тепер ми повинні взяти краплі від кожної тестової труби для аналізу. Таким чином, ми побачимо, в якій тестова трубка сидить необхідний білок.
Ви втомилися, і я втомився. Про ніч. Я не покажу вам весь аналіз, який займає близько 2 годин, і я не покажу вам, як я працював паралельно з іншим білком, я просто показати вам результати. У мене є прозорий запис в руці. Між двома шматочками скла в ньому є тонка пластина гелю. Гель - це така щільна речовина, схожа з консистенцією до плоского желатинового ведмедя. 2 години тому ми наносимо зразки білка, взяті з тестових труб до вершини гелю, а потім наносимо напругу. Оскільки білки заряджаються молекулами, вони ніде не заходять в електричне поле, ви повинні працювати від «мінусу» до «плюс» (точніше, щоб кожен разом з «плюсом», а не в різних напрямках). Але оскільки кальмари також відрізняються розмірами, дрібні збігаються швидше, ніж великі і жирні. В результаті знову відбувається поділ молекул за рахунок заряду/маси.
Ми візьмемо гелеву пластину зі скла, кладемо її в таз і пофарбуємо її синьою фарбою.
Потім ми очищаємо барвник. Цей барвник незворотно зв'язується з білками, тому де залишаються білки, сині смуги, а решта гелю знову стане безбарвним.
В цілому товсті сині смуги вказують на наявність білка в тестовій трубі. Мій ніжний Ми ретельно збираємо ці труби, що містять розчин білка, і після деяких маніпуляцій, заморожуємо їх вміст в рідкому азоті і зберігаємо їх як яблуко очей в тому, що морозильниця при -80 ° Р.
145528.
Нарешті, я покажу вам, як визначити концентрацію білка, використовуючи той же синій барвник (синій, більш білковий), адже красиво!
Тим не менш, мій "винтаж" телефон говорить, що це п'ятнадцять годину ввечері, і ми отримали до замкнути. У мене є кармічний зв'язок з цим телефоном, я намагався втратити його і викинути його сто разів, але він завжди повернувся до мене, вірно протягом 8 років і нічого не робиться до нього.
Дякуємо всім, хто читав на це місце і не збоїв.
Я зробив. Спасибі всім.
Джерело:
35 фото + листи
Всі ми були в школі, і у нас були біологія і хімія підручники. Деякі люди, ймовірно, читають їх до. Часом ми почуємо в новинах, які британські вчені здійснили черговий прорив і іноді навіть заслали Нобелівську премію за їх відкриття. І хто, мабуть, уявляв розумний сіро-волосий чоловік з келихами, хто все своє життя думав багато, був блискучим і колись він підсвічував ідею. Ну, я скажу вам це, в дійсності, є рідко одна людина за всіх цих відкриттів. Як правило, є завідувач лабораторії (і пізніше він дасть йому Нобелівську освіту в разі якого є ціла команда вчених, аспірантів, аспірантів і просто студентів). Важко уявити, скільки робіт насправді вводять в єдиний ряд біологія або хімія підручник. Визначені методи краще і більш точно вимірюють результат. Один експеримент може тривати з декількох годин до декількох років (в залежності від предмета дослідження). Один рядок у підручнику іноді займав роки
Так я студент біохіміолога, я 29 років, і я люблю, що називається Лу. Я жити життя експериментального вченого, і це життя нагадує мені дуже багато життя саркерів з деяких фантазійних книг. У наших вежах магії десятирівневих лабораторій, які з яких причин у багатьох містах світу проводяться поза межами міста, щоб не перетворити очі звичайних громадян, очевидно. Вже в Німеччині я мав офіційну адресу: "Вулиця так і-со, Вежа 4." Я зараз працює в Страсбург, Франція. Ми працюємо з усіма сортами пристроїв, метою яких не можна вгадати їх зовнішній вигляд, а також читати дивні листи, які за межами влади смертної, ініціатор повинен навчатися протягом багатьох років, щоб зрозуміти в них деякі девілі.
Хочу показати звичайний будиночок звичайного аспіранта (четвер 21.07.11 – хоча будні, вихідні, що різниця...) і докладно розповісти про те, що і чому ми працюємо, бо я люблю. З Про те, що люди роблять інші професії, я думав, що хтось може зацікавити вивчення біохіміки. Крім того, раптом якийсь сумнівний студент побачить цю посаду і вирішить, чи варто його відправити ноги в аспірантуру (це справа, дуже любитель). Я також справді цікавий, чи можу я пояснити фальману дуже базові техніки, що використовуються в біохімії. Так, в посту буде багато труб, дивних пристроїв, пристроїв, банок, капілярів. І багато пояснень і технічних деталей.
Я маю на увазі більшість людства, що є совами. Всі роки мого життя, проведеного в школі, університеті, праці, аспірантів та не зробили мене звикнути до відкликання життєрадісних ранок і швидко розвивається окропом. З якоїсь причини, є багато сов серед вчених, і вони, безумовно, швидко придумують наукову доказ, що ви сова або свинка, за рахунок особливостей вашого метаболізму. В цілому, цитуючи це докази, я мирно прокинувся три тривожні годинники (в 8:15, 8:45 і 9:00) до того, як біологічна тривога відходить. Мій біологічний набір до десь між 9:40 і 9:50. 10 хвилин після стирання очей, я все-таки кинувся в ліжку і відірвав вікно. Зовні вікна, якщо ви щасливі, вони дають вам хмари.
В кінці я все ж отримую, бо вчені не придумали телепорту. Тому що я люблю спати, я еволюціонував звичку готовності дуже швидко вранці. Я промив, отримаю, захоплюю сумку (його потрібно всього 10 хвилин для всього), не їсти сніданк і «за роботою, для роботи, до моєї улюбленої роботи !!!» Прогулянка по роботі також 10 хвилин. У кущах ми знаходяться.
...
Привіт, робоче місце!
...
Я отримаю, але, як і раніше вранці в моїй голові, я в автономному режимі. Мені потрібно пити каву (який майже не впливає на мене) і їсти щось солодке, потім дайте. Звичайно, не можна їсти і пити в лабораторії самостійно, але це можливо в спеціально призначеному для цього місці.
Після кави я все ще прочитав інтернет трохи, я явлю мій розум, я покладаю нітрилові рукавички на руках і бігу до розвитку насильницької діяльності. Ми працюємо, звичайно, всі час надягаючи рукавички, по-перше, так що все, що не стежить падає на руки, а по-друге, щоб не довести бруду в надчисті зразки.
Митець працює з пензлем, піаніст грає фортепіано, і я провадив цю трубу щодня. Цей вид трубок збирають невеликі обсяги рідин - все, що менше одного мілілітеру і до 1 мікролітера. Один мікролітер є таким крихітним падінням. Для порівняння, якщо ви заглиблюєте добре відоме скло труби, скажте, краплі в очах - потім одна така крапелька буде близько 200 мікролітерів. Трубка має знімний одноразовий наконечник, який можна побачити на фото, щоб кожна нова рідина набирається чистим наконечником.
Тепер кілька слів про те, що ми будемо робити сьогодні. Я вибрав найбільш типовий день для оповідання. Більшість післядипломних біохіміологів по всьому світу займаються досить монотонною діяльністю, а саме, очищаючи білки (= "протеїни") і поставляючи різні тести з ними. Білки – загальна назва для величезного класу біологічних молекул. Чому випускники по всьому світу мають стільки білків? Справа в тому, що в живих білках клітин виконують різні функції. Уявіть, скажте, автомобільна фабрика. Якщо вся рослина є живою коміркою, то практично все всередині — всі машини, транспортери, працівники та самі автомобілі — будуть білки. Вчені, перш за все, вивчити саме те, які функції виконує певний білок в клітині. По-друге, білки з відомими функціями можна використовувати як інструменти для подальших досліджень. Якщо ми хочемо використовувати білок, де ми отримуємо? Звісно в живому клітку! Це де вони виробляються в великих числах! Бактеріальні клітини найчастіше використовуються для цього, тому що вони дуже легко і недорого, щоб підтримувати і швидко рости. Методи сучасної генетичної інженерії дозволяють нам програмувати клітини так, щоб є велика кількість білків, які нам потрібно. А потім отримуємо його звідти і очищаємо його. І ми використовуємо його в експериментах.
Бактеріальні клітини вирощуються в рідкому поживному середовищі. Наприклад, в таких флаксах (пляшка на 5 л, рідина в ній 1 л), які знаходяться в кімнаті, де температура постійно підтримується при 37 ° С (або в термостатичному шафі). Флакс фіксуються на спеціальній платформі, яка постійно обертається і сяє вміст, при цьому поживний середовище збагачений киснем, і бактеріями краще з цього виростають. Це фото з вчора, але це весело побачити, де бактерії живуть в лабораторії. Ніч перед тим, як виростили бактерії до потрібного етапу, потім проповідували бактеріальні клітини з рідини (посмоктуються в центрифуги і скручуємо 6000 оборотів в хвилину, бактеріальні клітини є «свіжим», а отже оселилися до дна судна від центрифугальної сили), викопавши їх знизу посудину шпателем і миттєво заморожують в рідкому азоті (температурно-196 ° С). Миттєве заморожування є важливим для того, щоб клітини та їх вміст не починають зламатися від такого лікування бразен (і ми пам'ятаємо, що ми хочемо, щоб екстракт дорогоцінного білка, який біореакторні клітини зробили нас).
р.Так, о 11:08, і я зносу рукавички, що працюють на морозильну камеру, заморожують день до. Заморожені клітини та інші цінні зразки зберігаються в морозильній камері -80°C. Я відкрию морозильну камеру, і перше, що я з неї заливають товсту пару.
Швидко, щоб не заморожувати пальці в рукавичках, я кистью кашети, приготовані з вечора. Вони загорнуті в тантіль, і я ламав їх, як цукерковий бар на менші шматки, поки вони плавають. Коли вони щелепи, люмп клітин буде виглядати як шматок сіро-коричневого пластиліну з дуже яскравим запахом. Бактерія, яка зазвичай використовується в лабораторії, називається Escherichia coli, або E. coli для коротких. Це один і той самий кишковий коліт, який кілька кілограмів живуть в кишечнику кожного з нас. Не дивлячись на тіло, він, хоча він має дуже характерний запах, все ще запахи не відходи. Однак я боїться людей, які не звикли до неї, поціновувачі з тонким почуттям запаху, не б назвати цей запах приємним.
На шляху до морозильної камери ми зберемо лід в ящику - будемо тримати зразки на льоді, так як при низьких температурах всі з'єднання набагато стійкіше.
13469.
Ми кладемо плавлені клітини бактерій в тестовій трубі і заливаємо спеціальний розчин солі. Розчин необхідний для того, щоб білок ми намагалися витягти з клітин, що залишаються непристойними під час всіх процедур очищення. На фото ще одна трубка, більша, для томів до 30 мл.
Так ми маємо клітинки, які плавають в розчині. Всередині клітин є компонент (протеїн) ми бажаємо. Щоб отримати її, потрібно спочатку знищити клітинну мембрану так, щоб вміст розтопився. Існують різні способи знищити клітинку, залишаючи його вміст непристойним. Сьогодні ми використовуємо ультразвук для цього. І це те, що виглядає клітина-деструктор - це насправді металевий штифт, який ми будемо покласти прямо в тестовій трубі. Пиріг коливається на дуже високій частоті, створюючи ультразвукові хвилі в середовищі - з яких знищуються клітини. Пристосування дуже розтирання і шліфування, щоб вона була зафіксована в шафці з звукоізоляцією. І тестова трубка з клітинами необхідно тримати в льоді, тому що ультразвукові хвилі мають високу енергію, і зразок дуже гаряча.
Процедура руйнування займає близько 20 хвилин. Це фото показує, що перед руйнуванням клітин, зразок був більш світлим, після руйнування, його потемніли і стали більш в'язкими (візостійкість не видно, звичайно, але я кажу вам). В'язкість набута через те, що всі біополімери (довге молекули, як ДНК і білки), які були всередині клітин, зараз протікали.
Тепер у нас є свого роду «суп» сформований в тестовій трубі, в якій нічого не купує! Всі компоненти, які були в клітинах, і є тисячі з них, випливають і перемішують. Уявіть, що у вас є хороший пивоварний борщ, і вам якось потрібно отримати тільки крихітні шматочки петрушки з нього, і нічого іншого в будь-якому випадку отримується! Як? Ну, я не знаю про борщ, але як риба з правої молекули, біохіміки давно придумали. Ми будемо робити кілька кроків очищення. Перш за все, ми покладемо нашу «супу» в центрифугію і спину на порівняно низькій швидкості (10 000 об/хв). При цьому курсі великі частинки, такі як фрагменти бактеріальних стінок клітини, поселяться на дно, і всі менші частинки, включаючи наш білок, залишаться плаваючі в розчині. Це те, що трубка з осадом виглядає так - ми відкидаємо її, але будемо приймати рідину для подальшого очищення. Повідомляти, як темний він так далеко. 15 хвилин.
р.У наступному кроці ми позбавимо від нуклеїнових кислот (всі відомі ДНК і РНК), які також поплавляємо в зразок у великій кількості. Ми додамо спеціальний реагент, який викликає їх до преципітації. Фото показує зразок перед (лівою) і після (праворуч) додавання реагенту.
Ми збираємося поставити це в центрифугію, і ми будемо обертати його 10000 об/хв, і ми знову кидаємо його, і ми збираємося його назад. Повідомляйте, як яскрава. 20 хвилин.
Тепер існує ще один аналогічний крок очищення, монотонний, але ефективний. Останній етап обробки, потім більше задоволення Заливаємо строго визначену кількість білого порошку (соло сульфату амонію) в розчин. Невелика хитрість – це предпілювати багато різних білків, які нам не потрібно, і наш дорогоцінний збережеться в розчині! Декілька інших випускників років тому була заплутана і підбирала точну кількість білого порошку, потрібно взяти, і зараз я з використанням досвіду поколінь, щоб говорити. Але це просто означає, що я промовляю щось інше.
А що про зразок — ми вже знаємо, за встановленою схемою, ми закрутимо її в центрифуги, беремо рідину, переносимо її на чисту чашку і залишаємо її в холодильнику, тому що у нас є перерва на обід! Так це 13:00 на годинник.
5 хвилин до їдальні. Французька їдальня заслуговує ліричний відступ! Це найкраща їдальня я коли-небудь бачив, хоча вони кажуть, що це не найкращий в Страсбургі. Француженка, звичайно ж, не мусить їсти. У якій іншій їдальні ви знайдете близько десятків салатів самостійно, не кажучи вже про основні страви. Страви, до мого смаку, з захопленням - креветки з грейпфрутом, рокефорт з арубу, куркою з ананасом і тріщинами і все інше. Крім того, салати не просто розбризують на пластини великого басейну, так як вони роблять, наприклад, в Німеччині, і на кожну тарілку салат художньо прокладений - естетично складаний шинка, кладуть скибочку лимона / яйце / оливкова і навіть соус іноді заливають загартовою паличкою. Тексти пісень, а це означає: І перш за все, це смачно! Взагалі салати захопили мене, тому я їсти їх за найбільшу частину, і я навіть не доходжу до основних страв, але все також є художньою і смачною. Після того, як вони подарували деякі запіканки, запечені в великій оболонці в сирому соусі. У Німеччині я бачив багато різних цуценят, всі з них подаються до скидання, деякі смачні, але ніколи не приносили стільки естетичних до їжі. Ми часто їдемо на обід з двома щасливими колегами.
Але це 13:50 і час, щоб повернутися до роботи. Ми наносимо на петлю пальця і підійдемо до Північного полюса за цим практично броньованим дверима. Не жарт, що ми продовжуємо працювати в номері, де температура 4°C. Він холодний, людина.
Зовні двері! Це так! За дверима, серед інших речей, цей блок.
р.Я за пристрій.
Я зізнаю, що коли я побачила цей пристрій як студент, я майже побігся з страхом. Здавалося б, що це абсолютно неможливо зрозуміти що-небудь, і з точки зору складності було порівняти підводний човен. Навколо є кілька банок, конусів, пучок капілярів, які приклеюються з пристрою, кожен власному розчині, додаткові деталі прикріплюються до пристрою і непаровані, з яких є різні і різні. Ну, девіла гонна ламає ногу.
По суті, все стало набагато простіше. Це називається хроматографом. Застосовується при наявності суміші декількох компонентів і їх потрібно відокремити один від одного за допомогою. Хроматографи приходять в багато різних типів, зокрема, це рідкий хроматограф. Один з його компонентів є насосом, який здатний перекачувати рідину (тобто наш зразок) з точки A до точки B. По дорозі зразок пройде через спеціальну «очищаючу установу», яка дозволить нам позбутися від небажаних домішок. Розділені стовпчики в діапазоні:
Отже, перед обідом ми залишили напівочищену білкову суміш в холодильнику. Але є тільки один лівий! Поставте суміш в хроматограф і подивіться, що відбувається. Ми набираємо наш зразок в шприц і акуратно вставляємо його в внутрішню камеру хроматографа.
Потім натисніть кнопку старту і різко диміть в кутку, що дивиться на результат!
Як відокремити різні молекули один від одного? Існують різні способи. Кожен білок унікальний, має певні розміри, зарядні та поверхневі властивості. Ці якості будуть використовуватися для відокремлення суміші. Найчастіше застосовуються кілька кроків очищення, наприклад, спочатку за розміром, потім заряджаються.
Пам'ятка кіндерелла. Після того, як вона була надана сумкою різних злаків і розповіла про те, щоб взяти лише одну. Якщо Cinderella була технічна думка, вона підійшов з сито. І ще краще, кілька сидів в серії з клітинами різних розмірів. Так, спочатку можна взяти тільки найдрібніші, наприклад, пшениця, потім щось більший, наприклад, ленти, а потім ще більші, наприклад, горох, квасоля. Для окремих білків біохіміки придумали так званий «молекулярний сито» - матеріал, який має пори дуже, дуже невеликий розмір. Склад молекулярного сита полягає в тому, що це тривимірне. Повільний циліндр заповнюється мікроскопічними намистинами, і є отвори в бісерінці. Система працює таким чином: великі молекули не вписуються в отвори в бісерінці, тому вони швидко падають між намистинами, нічого не затримує їх. Невеликі молекули піднімуть в отвори в бісерінці і застрягають там, вони займають набагато довше, щоб досягти виходу. Рідкий вихід циліндра, спеціально підготовлений міні-робот відразу пропускає через труби. Оскільки великі і невеликі молекули залишають циліндр в різні часи, вони закінчуються в різних трубах. Ми просто повинні взяти потрібну тестову трубку, що містить продукт, який ми зацікавлені. І ми поділили молекули за розміром. Ні, я не знаю, чому поїзд говорить L'Oreal, я не працюю там.
Проведення сепарації молекул близько 4 годин. Після цього відділення іноді є багато труб на виході. Це так:
Якщо ви уважно дивитеся, то помітно, що 3 і 4 труби трохи відрізняються кольором, ніж всі інші. Попереду я можу сказати, що це буде продукт інтересу до нас. Розмальовуємо, нехай не йому, але деякі супутні сполуки, які ми позбавимо від майбутнього.
Але ми не знаємо нічого про це ще, ми тільки вгадуємо, де наш продукт може бути, тому що є вбудований детектор в хроматографі, який сяє через рідину, що протікає через неї з ультрафіолетовим світлом і «дивує» чи є щось в ньому або ні. Тим не менш, датчик може дати відповідь так/не, але не знаю, що присутній в кожній тестовій трубі. Тепер ми повинні взяти краплі від кожної тестової труби для аналізу. Таким чином, ми побачимо, в якій тестова трубка сидить необхідний білок.
Ви втомилися, і я втомився. Про ніч. Я не покажу вам весь аналіз, який займає близько 2 годин, і я не покажу вам, як я працював паралельно з іншим білком, я просто показати вам результати. У мене є прозорий запис в руці. Між двома шматочками скла в ньому є тонка пластина гелю. Гель - це така щільна речовина, схожа з консистенцією до плоского желатинового ведмедя. 2 години тому ми наносимо зразки білка, взяті з тестових труб до вершини гелю, а потім наносимо напругу. Оскільки білки заряджаються молекулами, вони ніде не заходять в електричне поле, ви повинні працювати від «мінусу» до «плюс» (точніше, щоб кожен разом з «плюсом», а не в різних напрямках). Але оскільки кальмари також відрізняються розмірами, дрібні збігаються швидше, ніж великі і жирні. В результаті знову відбувається поділ молекул за рахунок заряду/маси.
Ми візьмемо гелеву пластину зі скла, кладемо її в таз і пофарбуємо її синьою фарбою.
Потім ми очищаємо барвник. Цей барвник незворотно зв'язується з білками, тому де залишаються білки, сині смуги, а решта гелю знову стане безбарвним.
В цілому товсті сині смуги вказують на наявність білка в тестовій трубі. Мій ніжний Ми ретельно збираємо ці труби, що містять розчин білка, і після деяких маніпуляцій, заморожуємо їх вміст в рідкому азоті і зберігаємо їх як яблуко очей в тому, що морозильниця при -80 ° Р.
145528.
Нарешті, я покажу вам, як визначити концентрацію білка, використовуючи той же синій барвник (синій, більш білковий), адже красиво!
Тим не менш, мій "винтаж" телефон говорить, що це п'ятнадцять годину ввечері, і ми отримали до замкнути. У мене є кармічний зв'язок з цим телефоном, я намагався втратити його і викинути його сто разів, але він завжди повернувся до мене, вірно протягом 8 років і нічого не робиться до нього.
Дякуємо всім, хто читав на це місце і не збоїв.
Я зробив. Спасибі всім.
Джерело: