601
0,2
2015-07-04
Protein Diggers или Где добывают белОк биохимики
источник
35 фотографий + буквы
Все из нас учились в школе, и, в числе прочего, имели учебники по биологии и химии. Некоторые наверное их когда-то читали. Иногда мы слышим в новостях что британские учёные совершили очередной прорыв и иногда даже схлопотали Нобелевскую премию за своё открытие. И кто-то, возможно, воображает умного седого человека в очках, который всю жизнь много думал, был гениален и однажды его озарила идея. Ну, скажу вам так, в реальности за всеми этими открытиями редко стоит один человек. Обычно есть руководитель лаборатории (и это ему впоследствии дадут Нобелевскую в случае чего а работает целая команда учёных, аспирантов, магистрантов и просто студентов. Сложно себе представить, сколько труда на самом деле вложено в одну единственную строчку учебника биологии или химии. Аспиранты пробовали десятки комбинаций, чтобы узнать, как именно протекает некая реакция или процесс, выдумывали методы, как бы получше и поточнее измерить результат. Один эксперимент может тянуться от нескольких часов до нескольких лет (в зависимости от объекта исследования). На одну строчку в учебнике порой уходили годы человеко-труда.
Итак, я являюсь аспирантом-биохимиком, мне 29 лет и я люблю, когда меня называют Лу. Живу я жизнью учёного-экспериментатора, и мне эта жизнь очень сильно напоминает жизнь магов из какой-нибудь книжки-фэнтэзи. Целыми днями (по выходным нередко тоже) мы сидим в своих башнях магии десятого уровня лабораториях, которые почему-то в очень многих городах мира выносятся за черту города, чтобы не мозолить глаза простым горожанам, видимо. У меня даже в Германии официальный адрес был «улица такая-то, башня номер 4». В настоящий момент я работаю во Франции, в городе Страсбург. Мы работаем со всякими приборами, назначение которых уж никак нельзя угадать по их внешнему виду, и читаем странные письмена, которые не под силу простому смертному, а посвящённый должен учиться много лет, чтобы понять в них какого-нибудь чёрта.[next]
Я хочу показать обычный будний день обычного аспиранта (четверг 21.07.11 — хотя будний, выходной, какая разница...) и в подробностях рассказать, над чем и зачем мы работаем, потому что мне это нравится. Так как мне самой интересно читать о том, чем занимаются люди других профессий, я решила, что кому-то, наверное, будет интересно узнать про биохимиков. К тому же, вдруг какой-нибудь сомневающийся студент увидит этот пост и решит, стоит или не стоит ему направлять свои стопы в аспирантуру (это дело такое, очень на любителя). Ещё мне искренне любопытно, получится ли у меня объяснить неспециалисту суть самых основных методов, которые используются в биохимии. Итак, в посте будет очень много пробирок, странных устройств, приборов, баночек, капилляров. И много объяснений и технических подробностей.
Я отношусь к той большей части человечества, которая совы. Все годы жизни, проведённые в школе, университете, работе, магистратуре так и не заставили меня привыкнуть просыпаться бодрячком с утра и быстренько развивать кипучую деятельность. Среди учёных сов вообще почему-то очень много, и они уж конечно быстренько выдумали научное доказательство, что сова вы или жаворонок, объясняется особенностями вашего метаболизма. В общем, ссылаясь на это доказательство, я мирно просыпаю три будильника (в 8:15, 8:45 и 9:00), пока не срабатывает будильник биологический. Биологический у меня настроен где-то на 9:40 — 9:50. Минут 10 после продирания глаз я ещё мучительно ворочаюсь в кровати и зырю в окно. За окном, если повезёт, дают облака
В конце концов я всё-таки встаю, ибо телепорт учёные ещё не выдумали. По причине того, что я очень люблю поспать, у меня эволюционно выработалась привычка очень быстро собираться с утра. Я быстренько моюсь, одеваюсь, хватаю сумку (на всё про всё уходит ровно 10 минут), завтраков не ем и «на работу, на работу, на любимую работу!!!». Бежать на работу пешком тоже 10 минут. Вон наше НИИЧАВО в кустах виднеется.
…
Здравствуй, рабочее место!
…
Встать-то я встала, но поскольку у меня в голове всё ещё утро, я функционирую в режиме автопилота. Надо выпить кофе (который на меня почти не действует) и съесть что-то сладкое, тогда отпустит. Есть и пить в самой лаборатории, конечно же, нельзя, а можно в специально отведённом для этого месте
После кофе, я ещё немножко почитаю интернеты, в голове у меня прояснится, я натяну на руки нитриловые перчатки и побегу развивать бурную деятельность. Работаем мы, конечно же, всё время в перчатках, во-первых, чтобы не попадало на руки всё, что не следует, а во-вторых, чтобы не занести какой-нибудь грязи в суперчистые образцы.
Художник работает кистью, пианист играет на пианино, я же целый день размахиваю вот такой пипеткой. Такого рода пипетками набирают маленькие объёмы жидкостей — всё, что менее одного миллилитра и до 1 микролитра. Один микролитр — это такая малююююююсенькая капелька. Для сравнения, если вы капаете известной всем стеклянной пипеткой, скажем, капли в глаза — то в одной такой капле будет примерно 200 микролитров. Пипетка имеет съёмный одноразовый наконечник, который можно разглядеть на фотографии, чтобы каждую новую жидкость набирать чистым наконечником.
А теперь пару слов о том, чем именно мы собираемся сегодня заняться. Для рассказа я выбрала наиболее типичный день. Большинство аспирантов-биохимиков всего мира занимаются довольно однообразной деятельностью, а именно очищают белки ( = «протеины») и ставят с ними различные тесты. Белки — это общее название для огромного класса биологических молекул. Зачем аспирантам всего мира столько белков, спросите вы? Дело в том, что в живой клетке белки выполняют множество самых разнообразных функций. Представьте себе, скажем, завод по производству автомобилей. Если весь завод — это живая клетка, то почти всё, что в нём есть внутри — все станки, конвееры, рабочие, да и сами автомобили — это будут белки. Учёные, во-первых, изучают какие же именно функции выполняет тот или иной белок в клетке. Во-вторых, белки с уже известными функциями можно использовать в качестве инструментов для дальнейших исследований. Если мы хотим использовать какой-либо белок, то где же нам его взять? Конечно же в живой клетке! Ведь это именно на этой фабрике их производят в большом количестве! Для этого чаще всего используются клетки бактерий, потому что их очень просто и дёшево содержать и быстро выращивать. Методы современной генетической инженерии позволяют запрограммировать клетки так, чтобы там вырабатывалось большое количество нужного нам белка. А потом мы его оттуда достанем и почистим. И будем использовать в экспериментах.
Бактериальные клетки выращивают в жидкой питательной среде. Например, вот в таких колбах (колба на 5 л, жидкости в ней 1 л), которые находятся в комнате, где постоянно поддерживается температура 37°C (либо же в шкафу-термостате). Колбы закреплены на специальной платформе, которая постоянно вращается и взбалтывает содержимое, при этом питательная среда обогащается кислородом, а бактерии от этого лучше растут. Фотография эта из «вчера», но ведь прикольно посмотреть, где обитают бактерии в лаборатории. Накануне вечером мы вырастили бактерии до нужной стадии, потом осадили бактериальные клетки из жидкости (засунули в центрифугу и покрутили на 6000 оборотов в минуту, бактериальные клетки — «тяжёлые», и поэтому осели на дно посудины от центробежной силы), выковыряли их со дна посудины лопаточкой и мгновенно заморозили в жидком азоте (температура -196°C). Мгновенное замораживание важно для того, чтобы клетки и их содержимое не начали разрушаться от такого наглого обращения (а мы помним, что мы хотим добыть драгоценный белок, который клетки-биореакторы нам наработали).
Итак, на часах 11:08, и я в перчатках бегу в морозильную камеру за замороженным накануне образцом. Замороженные клетки и прочие ценные образцы хранятся в морозильных камерах на -80°C. Я открываю морозильную камеру и первым делом из неё валит густой пар.
Быстро, чтобы не отморозить себе пальцы в перчатках, я выхватываю приготовленные с вечера клетки. Они завёрнуты в фольгу и я разламываю их, как шоколадку, на кусочки помельче, пока не растаяли. Когда они оттают, комочек клеток будет похож на кусочек серо-коричневого пластилина с очень характерным запахом. Бактерия, которая стандартно используется для работы в лаборатории, называется кишечная палочка (Escherichia coli, или, сокращённо, E. coli). Это та самая кишечная палочка, которой несколько киллограммов проживает в кишечнике каждого из нас. Будучи вне организма, она, хоть и имеет очень характерный запах, но пахнет всё-таки совсем не отходами жизнедеятельности. Однако боюсь, люди непривыкшие, ценители с тонким обонянием, не назвали бы этот запах приятным.
По дороге к морозильной камере заодно наберём льда в коробочку — будем держать образцы на льду, так как при низких температурах все соединения гораздо стабильнее.
Растаявшие клетки бактерий мы положим в пробирку и зальём специальным раствором солей. Раствор нужен для того, чтобы белок, который мы пытаемся добыть из клеток, остался в целости и сохранности в ходе всех процедур очистки. На фотографии другая пипетка, побольше, на объёмы до 30 мл.
Итак у нас есть клетки, которые плавают в растворе. Внутри клеток есть страстно желаемый нами компонент (белок). Чтобы его получить, нужно для начала разрушить клеточную мембрану, чтобы содержимое вылилось наружу. Существуют различные способы разрушить клетку, оставив нетронутым её содержимое. Сегодня мы будет использовать для этой цели ультразвук. А вот так выглядит прибор для разрушения клеток — собственно, он представляет из себя металлический штырь, который мы засунем прямо в пробирку. Штырь колеблется с очень высокой частотой, создавая ультразвуковые волны в среде — от этого клетки разрушаются. Прибор при этом очень противно верещит и скрежещет, так что его запирают в шкафчик со звукоизоляцией. А пробирку с клетками необходимо держать во льду, потому что ультразвуковые волны обладают высокой энергией, и образец очень сильно разогревается.
Процедура разрушения занимает около 20 мин. На этой фотографии видно, что до разрушения клеток образец был более светлым, после разрушения же потемнел и стал более вязким (вязкости не видно, конечно, но я вам говорю). Вязкость приобретается за счёт того, что все биополимеры (очень длинные молекулы вроде ДНК и белков), которые были внутри клеток, теперь вытекли наружу.
Теперь у нас в пробирке образовался своеобразный «суп», в котором чего только не плавает! Все компоненты, которые были в клетках, а их тысячи, вытекли наружу и перемешались. Представьте, что у вас есть хороший наваристый борщ, и вам каким-то чудом нужно выудить из него лишь малюсенькие кусочки петрушки, и чтобы ничего другого ни в коем случае не попало! Как? Ну, про борщ не знаю, а как выудить нужную молекулу, биохимики давно придумали. Мы проведём несколько стадий очистки. Первым делом засунем наш «суп» в центрифугу и раскрутим с относительно небольшой скоростью (10000 об/мин). При такой скорости на дно осядут большие частицы, например обломки клеточных стенок бактерий, а все частицы поменьше, включая наш белок, останутся плавать в растворе. Так выглядит пробирка с осадком — его мы выбросим, а вот жидкость мы заберем для дальнейшей очистки. Обратите внимание, какая она пока что тёмная. Этап занял 15 мин.
На следующем этапе мы избавимся от нуклеиновых кислот (всем известные ДНК и РНК), которые тоже плавают в образце в большом количестве. Мы добавим специальный реагент, который заствляет выпасть их в осадок. На фотографии — образец до (слева) и после (справа) добавления реагента.
Это дело мы тоже засунем в центрифугу, и тоже покрутим на 10000 об/мин, и всё, что уйдёт в осадок, снова выбросим, а жидкость снова заберём себе. Обратите внимание, как она посветлела. Заняло около 20 мин.
Теперь ещё один схожий этап очистки — однообразно, но эффективно. Последний скучный этап, дальше веселее Мы насыпем строго определённое количество белого порошка (соли сульфата аммония) в раствор. Маленькая хитрость — при этом выпадет в осадок много разных белков, которые нам не нужны, а наш драгоценный останется плавать в растворе! Какой-то другой аспирант много лет назад мучался и подбирал точное количество белого порошка, которое нужно для этого взять, а я теперь использую опыт поколений, так сказать. Но это лишь значит, что я мучаюсь над чем-то другим.
А что же дальше с образцом — мы уже знаем, по устоявшейся схеме покрутим его в центрифуге, заберём жидкость, перенесём ее в чистый стаканчик и так и оставим стоять в холодильнике, потому что у нас перерыв на обед! А стало быть, на часах уже 13:00.
До столовой топать минут 5. Французская столовая заслуживает лирического отступления! Это лучшая столовая из всех виденных мной, хотя, говорят, далеко не лучшая в Страсбурге. Французы, конечно, не дураки покушать. В какой ещё столовой вы найдёте около десятка одних только салатов, не говоря уже про главные блюда. Блюда, на мой вкус, с изысками — креветки с грейпфрутом, рокфор с рукколой, цыплёнок с ананасом и сухариками и всё что угодно ещё. К тому же, салаты не просто плюхнуты в тарелки из большого тазика, как это делают, например, в Германии, а на каждой тарелочке салат разложен художественно — эстетично свёрнута ветчина, положена долька лимона/яйца/оливочка и даже соус порой налит вычурным вензелем. И главное, вкусно! В общем, салаты меня пленили, поэтому я питаюсь по большей части ими, а до главных блюд даже не дохожу, но там тоже всё художественно и вкусно. Как-то раз выдавали каких-то моллюсков, запечённых в большой раковине в сырном соусе. В Германии я видала много разных столовых, во всех из них кормили до отвала, в некоторых — вкусно, но никогда не было привнесено в еду столько эстетства. На обед мы ходим чаще всего с двумя весёлыми коллегами.
Однако уже 13:50, и пора снова за работу. Напялим-ка мы тулуп и отправимся на северный полюс за вот эту почти бронированную дверь. Про тулуп не шутка — мы будем продолжать работу в комнате, где всё время поддерживается температура +4°C. Холодно, блин.
А за дверью-то, за дверью!!! Там такое, такое! За дверью находится, в числе прочего, вот такой агрегат.
За прибором я, всем превед.
Признаюсь, когда я впервые увидела такой прибор, будучи студенткой, я чуть не убежала со страху. Мне казалось, что понять в нём решительно ничего невозможно, а по сложности он сравним с подводной лодкой. Вокруг стоят какие-то баночки, колбочки, из прибора торчит куча капилляров, каждый в своём растворе, к прибору прицепляются и отцепляются дополнительные детали, коих присутствует во множестве и разнообразии. В общем, чёрт ногу сломит.
На самом деле всё оказалось значительно проще. Прибор называется хроматограф. Он используется тогда, когда имеется смесь из несколькиз компонентов и их необходимо отделить один от другого каким-то образом. Хроматографы бывают разных типов, конкретно этот — жидкостный хроматограф. Одной из его составляющих является насос, который умеет перекачивать жидкость (то есть наш образец) из пункта А в пункт Б. По пути образец пройдёт сквозь специальное «очистительное сооружение», что позволит нам избавиться от нежелательных примесей. Разделяющие колонки в ассортименте:
Итак, до перерыва но обед мы оставили в холодильнике уже наполовину очищенную смесь белков. Однако остаться должен только один! Засунем-ка смесь в хроматограф и посмотрим, что получится. Наберём наш образец в шприц и аккуратно введём во внутреннюю камеру хроматографа.
Потом нажмём на кнопку «старт» и будем нервно курить в углу с нетерпением ждать результата!
Как же отделить различные молекулы друг от друга? Существуют различные способы. Каждый белок по-своему уникален, имеет определённый размер, заряд и свойства поверхности. Именно эти качества и будут использоваться для разделения смеси. Чаще всего используется последовательно несколько этапов очистки, например, сначала по размеру, потом по заряду.
Вспомним Золушку. Как-то раз ей выдали мешок разных круп и велели отобрать оттуда только что-то одно. Если бы Золушка имела технический склад ума, она придумала бы использовать для этого сито. А ещё лучше несколько сит последовательно с ячейками разного размера. Так, сначала можно было бы отобрать только самое маленькое, например, пшено, потом что-то побольше, например, чечевицу, а потом еще побольше, например горох, фасоль. Для разделения белков биохимики выдумали так называемое «молекулярное сито» — материал, имеющий поры очень-очень маленького размера. Хитрость молекулярного сита ещё и в том, что оно трёхмерное. Полый цилиндр заполнен микроскопическими бусинами, а в бусинах сквозные дырочки. Система работает так: большие молекулы не влазят в дырочки в бусинах, поэтому быстро проваливаются вниз между бусинами, их ничто не задерживает. Маленькие молекулы пролазят в дырочки в бусинах и застревают там, им требуется значительно больше времени, чтобы достигнуть выхода. Жидкость, выходящую из цилиндра, специально обученный мини-робот сразу раскапывает по пробиркам. Так как большие и маленькие молекулы покинут цилиндр в различное время, они в результате окажутся в разных пробирках. Нам останется просто взять нужную пробирку, содержащую интересующий нас продукт. Вот так мы и разделили молекулы по размеру. Вуаля! (нет, я не знаю, почему на штативе написано L'Oreal, я вовсе не там работаю).
Разделение молекул заняло около 4 часов. После такого разделения порой получается очень много пробирок на выходе. Примерно вот столько:
Если присмотреться, то заметно, что 3 и 4 пробирки немного другого цвета, чем все остальные. Забегая вперёд, могу сказать, что там и окажется интересующий нас продукт. Окрашен, правда не он, а какое-то сопутсвующее ему соединение, от которого мы будем избавляться в дальнейшем.
Но пока что ещё мы ничего такого не знаем, мы только предполагаем, где примерно может оказаться наш продукт, потому что в хроматографе есть встроенный детектор, который просвечивает протекающую по нему жидкость ультрафиолетом и «видит», присутствует ли в ней что-то или нет. Однако, детектор может дать только ответ да/нет, но он не знает, что именно присутствует в каждой пробирке. Поэтому нам надо теперь взять по капельке из каждой пробирки для анализа. Таким образом мы увидим, в какой пробирке сидит желаемый нами белок.
Вы устали, и я устала. Уже дело к ночи. Поэтому я не показываю всю процедуру анализа, которая занимает около 2х часов, и не показываю, как я параллельно ещё с другим белком работала, а показываю только результат. Вот у меня в руке прозрачная пластинка. Между двумя кусочками стекла в ней находится тонкая пластинка геля. Гель — это такая плотная субстанция, по консистенции похожая на расплющенного желатинового мишку. 2 часа назад мы нанесли образцы белка, взятые из пробирок, на верхнюю часть геля, а потом подали напряжение. Поскольку белки — молекулы заряженные, в электрическом поле деваться им некуда, приходится бежать от «минуса» к «плюсу» (существует некоторая хитрость, чтобы все дружно бежали именно к «плюсу», а не в разных направлениях). Но поскольку белки ещё и размера разного, то маленькие бегут быстрее больших и толстых (совсем как люди. В результате опять получается разделение молекул по заряду/массе.
Пластинку геля мы достанем из стёкол, положим в лоханку и покрасим синеньким красителем.
Затем отмоем краситель. Этот краситель необратимо связывается с белками, поэтому там, где бежали белки, останутся синенькие полоски, а весь остальной гель снова станет бесцветным.
В общем, толстенькие синие полоски означают наличие белка в пробирке. Моя щаслив! Мы трепетно соберём эти пробирки, содержащие раствор белка, и после некоторых манипуляций заморозим их содержимое в жидком азоте и будем хранить как зеницу ока в той самой морозильной камере на -80°C.
Напоследок покажу, как определяют концентрацию белка, пользуясь тем же самым синеньким красителем (чем синее, тем белка больше), ибо красиво!
Тем временем мой «винтажный» телефон сообщает, что уже без пятнадцати одиннадцать вечера, и надо потихоньку сворачиваться. С этим телефоном у меня прямо кармическая связь какая-то, я его и терять пыталась, и роняла сто раз, но он всегда ко мне возвращался, служит верой и правдой вот уже 8 лет и ничего ему не делается.
Спасибо всем, кто дочитал до этого места и не очумел
У меня все. Всем спасибо за внимание
Источник: www.yaplakal.com/
35 фотографий + буквы
Все из нас учились в школе, и, в числе прочего, имели учебники по биологии и химии. Некоторые наверное их когда-то читали. Иногда мы слышим в новостях что британские учёные совершили очередной прорыв и иногда даже схлопотали Нобелевскую премию за своё открытие. И кто-то, возможно, воображает умного седого человека в очках, который всю жизнь много думал, был гениален и однажды его озарила идея. Ну, скажу вам так, в реальности за всеми этими открытиями редко стоит один человек. Обычно есть руководитель лаборатории (и это ему впоследствии дадут Нобелевскую в случае чего а работает целая команда учёных, аспирантов, магистрантов и просто студентов. Сложно себе представить, сколько труда на самом деле вложено в одну единственную строчку учебника биологии или химии. Аспиранты пробовали десятки комбинаций, чтобы узнать, как именно протекает некая реакция или процесс, выдумывали методы, как бы получше и поточнее измерить результат. Один эксперимент может тянуться от нескольких часов до нескольких лет (в зависимости от объекта исследования). На одну строчку в учебнике порой уходили годы человеко-труда.
Итак, я являюсь аспирантом-биохимиком, мне 29 лет и я люблю, когда меня называют Лу. Живу я жизнью учёного-экспериментатора, и мне эта жизнь очень сильно напоминает жизнь магов из какой-нибудь книжки-фэнтэзи. Целыми днями (по выходным нередко тоже) мы сидим в своих башнях магии десятого уровня лабораториях, которые почему-то в очень многих городах мира выносятся за черту города, чтобы не мозолить глаза простым горожанам, видимо. У меня даже в Германии официальный адрес был «улица такая-то, башня номер 4». В настоящий момент я работаю во Франции, в городе Страсбург. Мы работаем со всякими приборами, назначение которых уж никак нельзя угадать по их внешнему виду, и читаем странные письмена, которые не под силу простому смертному, а посвящённый должен учиться много лет, чтобы понять в них какого-нибудь чёрта.[next]
Я хочу показать обычный будний день обычного аспиранта (четверг 21.07.11 — хотя будний, выходной, какая разница...) и в подробностях рассказать, над чем и зачем мы работаем, потому что мне это нравится. Так как мне самой интересно читать о том, чем занимаются люди других профессий, я решила, что кому-то, наверное, будет интересно узнать про биохимиков. К тому же, вдруг какой-нибудь сомневающийся студент увидит этот пост и решит, стоит или не стоит ему направлять свои стопы в аспирантуру (это дело такое, очень на любителя). Ещё мне искренне любопытно, получится ли у меня объяснить неспециалисту суть самых основных методов, которые используются в биохимии. Итак, в посте будет очень много пробирок, странных устройств, приборов, баночек, капилляров. И много объяснений и технических подробностей.
Я отношусь к той большей части человечества, которая совы. Все годы жизни, проведённые в школе, университете, работе, магистратуре так и не заставили меня привыкнуть просыпаться бодрячком с утра и быстренько развивать кипучую деятельность. Среди учёных сов вообще почему-то очень много, и они уж конечно быстренько выдумали научное доказательство, что сова вы или жаворонок, объясняется особенностями вашего метаболизма. В общем, ссылаясь на это доказательство, я мирно просыпаю три будильника (в 8:15, 8:45 и 9:00), пока не срабатывает будильник биологический. Биологический у меня настроен где-то на 9:40 — 9:50. Минут 10 после продирания глаз я ещё мучительно ворочаюсь в кровати и зырю в окно. За окном, если повезёт, дают облака
В конце концов я всё-таки встаю, ибо телепорт учёные ещё не выдумали. По причине того, что я очень люблю поспать, у меня эволюционно выработалась привычка очень быстро собираться с утра. Я быстренько моюсь, одеваюсь, хватаю сумку (на всё про всё уходит ровно 10 минут), завтраков не ем и «на работу, на работу, на любимую работу!!!». Бежать на работу пешком тоже 10 минут. Вон наше НИИЧАВО в кустах виднеется.
…
Здравствуй, рабочее место!
…
Встать-то я встала, но поскольку у меня в голове всё ещё утро, я функционирую в режиме автопилота. Надо выпить кофе (который на меня почти не действует) и съесть что-то сладкое, тогда отпустит. Есть и пить в самой лаборатории, конечно же, нельзя, а можно в специально отведённом для этого месте
После кофе, я ещё немножко почитаю интернеты, в голове у меня прояснится, я натяну на руки нитриловые перчатки и побегу развивать бурную деятельность. Работаем мы, конечно же, всё время в перчатках, во-первых, чтобы не попадало на руки всё, что не следует, а во-вторых, чтобы не занести какой-нибудь грязи в суперчистые образцы.
Художник работает кистью, пианист играет на пианино, я же целый день размахиваю вот такой пипеткой. Такого рода пипетками набирают маленькие объёмы жидкостей — всё, что менее одного миллилитра и до 1 микролитра. Один микролитр — это такая малююююююсенькая капелька. Для сравнения, если вы капаете известной всем стеклянной пипеткой, скажем, капли в глаза — то в одной такой капле будет примерно 200 микролитров. Пипетка имеет съёмный одноразовый наконечник, который можно разглядеть на фотографии, чтобы каждую новую жидкость набирать чистым наконечником.
А теперь пару слов о том, чем именно мы собираемся сегодня заняться. Для рассказа я выбрала наиболее типичный день. Большинство аспирантов-биохимиков всего мира занимаются довольно однообразной деятельностью, а именно очищают белки ( = «протеины») и ставят с ними различные тесты. Белки — это общее название для огромного класса биологических молекул. Зачем аспирантам всего мира столько белков, спросите вы? Дело в том, что в живой клетке белки выполняют множество самых разнообразных функций. Представьте себе, скажем, завод по производству автомобилей. Если весь завод — это живая клетка, то почти всё, что в нём есть внутри — все станки, конвееры, рабочие, да и сами автомобили — это будут белки. Учёные, во-первых, изучают какие же именно функции выполняет тот или иной белок в клетке. Во-вторых, белки с уже известными функциями можно использовать в качестве инструментов для дальнейших исследований. Если мы хотим использовать какой-либо белок, то где же нам его взять? Конечно же в живой клетке! Ведь это именно на этой фабрике их производят в большом количестве! Для этого чаще всего используются клетки бактерий, потому что их очень просто и дёшево содержать и быстро выращивать. Методы современной генетической инженерии позволяют запрограммировать клетки так, чтобы там вырабатывалось большое количество нужного нам белка. А потом мы его оттуда достанем и почистим. И будем использовать в экспериментах.
Бактериальные клетки выращивают в жидкой питательной среде. Например, вот в таких колбах (колба на 5 л, жидкости в ней 1 л), которые находятся в комнате, где постоянно поддерживается температура 37°C (либо же в шкафу-термостате). Колбы закреплены на специальной платформе, которая постоянно вращается и взбалтывает содержимое, при этом питательная среда обогащается кислородом, а бактерии от этого лучше растут. Фотография эта из «вчера», но ведь прикольно посмотреть, где обитают бактерии в лаборатории. Накануне вечером мы вырастили бактерии до нужной стадии, потом осадили бактериальные клетки из жидкости (засунули в центрифугу и покрутили на 6000 оборотов в минуту, бактериальные клетки — «тяжёлые», и поэтому осели на дно посудины от центробежной силы), выковыряли их со дна посудины лопаточкой и мгновенно заморозили в жидком азоте (температура -196°C). Мгновенное замораживание важно для того, чтобы клетки и их содержимое не начали разрушаться от такого наглого обращения (а мы помним, что мы хотим добыть драгоценный белок, который клетки-биореакторы нам наработали).
Итак, на часах 11:08, и я в перчатках бегу в морозильную камеру за замороженным накануне образцом. Замороженные клетки и прочие ценные образцы хранятся в морозильных камерах на -80°C. Я открываю морозильную камеру и первым делом из неё валит густой пар.
Быстро, чтобы не отморозить себе пальцы в перчатках, я выхватываю приготовленные с вечера клетки. Они завёрнуты в фольгу и я разламываю их, как шоколадку, на кусочки помельче, пока не растаяли. Когда они оттают, комочек клеток будет похож на кусочек серо-коричневого пластилина с очень характерным запахом. Бактерия, которая стандартно используется для работы в лаборатории, называется кишечная палочка (Escherichia coli, или, сокращённо, E. coli). Это та самая кишечная палочка, которой несколько киллограммов проживает в кишечнике каждого из нас. Будучи вне организма, она, хоть и имеет очень характерный запах, но пахнет всё-таки совсем не отходами жизнедеятельности. Однако боюсь, люди непривыкшие, ценители с тонким обонянием, не назвали бы этот запах приятным.
По дороге к морозильной камере заодно наберём льда в коробочку — будем держать образцы на льду, так как при низких температурах все соединения гораздо стабильнее.
Растаявшие клетки бактерий мы положим в пробирку и зальём специальным раствором солей. Раствор нужен для того, чтобы белок, который мы пытаемся добыть из клеток, остался в целости и сохранности в ходе всех процедур очистки. На фотографии другая пипетка, побольше, на объёмы до 30 мл.
Итак у нас есть клетки, которые плавают в растворе. Внутри клеток есть страстно желаемый нами компонент (белок). Чтобы его получить, нужно для начала разрушить клеточную мембрану, чтобы содержимое вылилось наружу. Существуют различные способы разрушить клетку, оставив нетронутым её содержимое. Сегодня мы будет использовать для этой цели ультразвук. А вот так выглядит прибор для разрушения клеток — собственно, он представляет из себя металлический штырь, который мы засунем прямо в пробирку. Штырь колеблется с очень высокой частотой, создавая ультразвуковые волны в среде — от этого клетки разрушаются. Прибор при этом очень противно верещит и скрежещет, так что его запирают в шкафчик со звукоизоляцией. А пробирку с клетками необходимо держать во льду, потому что ультразвуковые волны обладают высокой энергией, и образец очень сильно разогревается.
Процедура разрушения занимает около 20 мин. На этой фотографии видно, что до разрушения клеток образец был более светлым, после разрушения же потемнел и стал более вязким (вязкости не видно, конечно, но я вам говорю). Вязкость приобретается за счёт того, что все биополимеры (очень длинные молекулы вроде ДНК и белков), которые были внутри клеток, теперь вытекли наружу.
Теперь у нас в пробирке образовался своеобразный «суп», в котором чего только не плавает! Все компоненты, которые были в клетках, а их тысячи, вытекли наружу и перемешались. Представьте, что у вас есть хороший наваристый борщ, и вам каким-то чудом нужно выудить из него лишь малюсенькие кусочки петрушки, и чтобы ничего другого ни в коем случае не попало! Как? Ну, про борщ не знаю, а как выудить нужную молекулу, биохимики давно придумали. Мы проведём несколько стадий очистки. Первым делом засунем наш «суп» в центрифугу и раскрутим с относительно небольшой скоростью (10000 об/мин). При такой скорости на дно осядут большие частицы, например обломки клеточных стенок бактерий, а все частицы поменьше, включая наш белок, останутся плавать в растворе. Так выглядит пробирка с осадком — его мы выбросим, а вот жидкость мы заберем для дальнейшей очистки. Обратите внимание, какая она пока что тёмная. Этап занял 15 мин.
На следующем этапе мы избавимся от нуклеиновых кислот (всем известные ДНК и РНК), которые тоже плавают в образце в большом количестве. Мы добавим специальный реагент, который заствляет выпасть их в осадок. На фотографии — образец до (слева) и после (справа) добавления реагента.
Это дело мы тоже засунем в центрифугу, и тоже покрутим на 10000 об/мин, и всё, что уйдёт в осадок, снова выбросим, а жидкость снова заберём себе. Обратите внимание, как она посветлела. Заняло около 20 мин.
Теперь ещё один схожий этап очистки — однообразно, но эффективно. Последний скучный этап, дальше веселее Мы насыпем строго определённое количество белого порошка (соли сульфата аммония) в раствор. Маленькая хитрость — при этом выпадет в осадок много разных белков, которые нам не нужны, а наш драгоценный останется плавать в растворе! Какой-то другой аспирант много лет назад мучался и подбирал точное количество белого порошка, которое нужно для этого взять, а я теперь использую опыт поколений, так сказать. Но это лишь значит, что я мучаюсь над чем-то другим.
А что же дальше с образцом — мы уже знаем, по устоявшейся схеме покрутим его в центрифуге, заберём жидкость, перенесём ее в чистый стаканчик и так и оставим стоять в холодильнике, потому что у нас перерыв на обед! А стало быть, на часах уже 13:00.
До столовой топать минут 5. Французская столовая заслуживает лирического отступления! Это лучшая столовая из всех виденных мной, хотя, говорят, далеко не лучшая в Страсбурге. Французы, конечно, не дураки покушать. В какой ещё столовой вы найдёте около десятка одних только салатов, не говоря уже про главные блюда. Блюда, на мой вкус, с изысками — креветки с грейпфрутом, рокфор с рукколой, цыплёнок с ананасом и сухариками и всё что угодно ещё. К тому же, салаты не просто плюхнуты в тарелки из большого тазика, как это делают, например, в Германии, а на каждой тарелочке салат разложен художественно — эстетично свёрнута ветчина, положена долька лимона/яйца/оливочка и даже соус порой налит вычурным вензелем. И главное, вкусно! В общем, салаты меня пленили, поэтому я питаюсь по большей части ими, а до главных блюд даже не дохожу, но там тоже всё художественно и вкусно. Как-то раз выдавали каких-то моллюсков, запечённых в большой раковине в сырном соусе. В Германии я видала много разных столовых, во всех из них кормили до отвала, в некоторых — вкусно, но никогда не было привнесено в еду столько эстетства. На обед мы ходим чаще всего с двумя весёлыми коллегами.
Однако уже 13:50, и пора снова за работу. Напялим-ка мы тулуп и отправимся на северный полюс за вот эту почти бронированную дверь. Про тулуп не шутка — мы будем продолжать работу в комнате, где всё время поддерживается температура +4°C. Холодно, блин.
А за дверью-то, за дверью!!! Там такое, такое! За дверью находится, в числе прочего, вот такой агрегат.
За прибором я, всем превед.
Признаюсь, когда я впервые увидела такой прибор, будучи студенткой, я чуть не убежала со страху. Мне казалось, что понять в нём решительно ничего невозможно, а по сложности он сравним с подводной лодкой. Вокруг стоят какие-то баночки, колбочки, из прибора торчит куча капилляров, каждый в своём растворе, к прибору прицепляются и отцепляются дополнительные детали, коих присутствует во множестве и разнообразии. В общем, чёрт ногу сломит.
На самом деле всё оказалось значительно проще. Прибор называется хроматограф. Он используется тогда, когда имеется смесь из несколькиз компонентов и их необходимо отделить один от другого каким-то образом. Хроматографы бывают разных типов, конкретно этот — жидкостный хроматограф. Одной из его составляющих является насос, который умеет перекачивать жидкость (то есть наш образец) из пункта А в пункт Б. По пути образец пройдёт сквозь специальное «очистительное сооружение», что позволит нам избавиться от нежелательных примесей. Разделяющие колонки в ассортименте:
Итак, до перерыва но обед мы оставили в холодильнике уже наполовину очищенную смесь белков. Однако остаться должен только один! Засунем-ка смесь в хроматограф и посмотрим, что получится. Наберём наш образец в шприц и аккуратно введём во внутреннюю камеру хроматографа.
Потом нажмём на кнопку «старт» и будем нервно курить в углу с нетерпением ждать результата!
Как же отделить различные молекулы друг от друга? Существуют различные способы. Каждый белок по-своему уникален, имеет определённый размер, заряд и свойства поверхности. Именно эти качества и будут использоваться для разделения смеси. Чаще всего используется последовательно несколько этапов очистки, например, сначала по размеру, потом по заряду.
Вспомним Золушку. Как-то раз ей выдали мешок разных круп и велели отобрать оттуда только что-то одно. Если бы Золушка имела технический склад ума, она придумала бы использовать для этого сито. А ещё лучше несколько сит последовательно с ячейками разного размера. Так, сначала можно было бы отобрать только самое маленькое, например, пшено, потом что-то побольше, например, чечевицу, а потом еще побольше, например горох, фасоль. Для разделения белков биохимики выдумали так называемое «молекулярное сито» — материал, имеющий поры очень-очень маленького размера. Хитрость молекулярного сита ещё и в том, что оно трёхмерное. Полый цилиндр заполнен микроскопическими бусинами, а в бусинах сквозные дырочки. Система работает так: большие молекулы не влазят в дырочки в бусинах, поэтому быстро проваливаются вниз между бусинами, их ничто не задерживает. Маленькие молекулы пролазят в дырочки в бусинах и застревают там, им требуется значительно больше времени, чтобы достигнуть выхода. Жидкость, выходящую из цилиндра, специально обученный мини-робот сразу раскапывает по пробиркам. Так как большие и маленькие молекулы покинут цилиндр в различное время, они в результате окажутся в разных пробирках. Нам останется просто взять нужную пробирку, содержащую интересующий нас продукт. Вот так мы и разделили молекулы по размеру. Вуаля! (нет, я не знаю, почему на штативе написано L'Oreal, я вовсе не там работаю).
Разделение молекул заняло около 4 часов. После такого разделения порой получается очень много пробирок на выходе. Примерно вот столько:
Если присмотреться, то заметно, что 3 и 4 пробирки немного другого цвета, чем все остальные. Забегая вперёд, могу сказать, что там и окажется интересующий нас продукт. Окрашен, правда не он, а какое-то сопутсвующее ему соединение, от которого мы будем избавляться в дальнейшем.
Но пока что ещё мы ничего такого не знаем, мы только предполагаем, где примерно может оказаться наш продукт, потому что в хроматографе есть встроенный детектор, который просвечивает протекающую по нему жидкость ультрафиолетом и «видит», присутствует ли в ней что-то или нет. Однако, детектор может дать только ответ да/нет, но он не знает, что именно присутствует в каждой пробирке. Поэтому нам надо теперь взять по капельке из каждой пробирки для анализа. Таким образом мы увидим, в какой пробирке сидит желаемый нами белок.
Вы устали, и я устала. Уже дело к ночи. Поэтому я не показываю всю процедуру анализа, которая занимает около 2х часов, и не показываю, как я параллельно ещё с другим белком работала, а показываю только результат. Вот у меня в руке прозрачная пластинка. Между двумя кусочками стекла в ней находится тонкая пластинка геля. Гель — это такая плотная субстанция, по консистенции похожая на расплющенного желатинового мишку. 2 часа назад мы нанесли образцы белка, взятые из пробирок, на верхнюю часть геля, а потом подали напряжение. Поскольку белки — молекулы заряженные, в электрическом поле деваться им некуда, приходится бежать от «минуса» к «плюсу» (существует некоторая хитрость, чтобы все дружно бежали именно к «плюсу», а не в разных направлениях). Но поскольку белки ещё и размера разного, то маленькие бегут быстрее больших и толстых (совсем как люди. В результате опять получается разделение молекул по заряду/массе.
Пластинку геля мы достанем из стёкол, положим в лоханку и покрасим синеньким красителем.
Затем отмоем краситель. Этот краситель необратимо связывается с белками, поэтому там, где бежали белки, останутся синенькие полоски, а весь остальной гель снова станет бесцветным.
В общем, толстенькие синие полоски означают наличие белка в пробирке. Моя щаслив! Мы трепетно соберём эти пробирки, содержащие раствор белка, и после некоторых манипуляций заморозим их содержимое в жидком азоте и будем хранить как зеницу ока в той самой морозильной камере на -80°C.
Напоследок покажу, как определяют концентрацию белка, пользуясь тем же самым синеньким красителем (чем синее, тем белка больше), ибо красиво!
Тем временем мой «винтажный» телефон сообщает, что уже без пятнадцати одиннадцать вечера, и надо потихоньку сворачиваться. С этим телефоном у меня прямо кармическая связь какая-то, я его и терять пыталась, и роняла сто раз, но он всегда ко мне возвращался, служит верой и правдой вот уже 8 лет и ничего ему не делается.
Спасибо всем, кто дочитал до этого места и не очумел
У меня все. Всем спасибо за внимание
Источник: www.yaplakal.com/
